易基因: Nat Plants：南科大朱健康/华中农大赵伦团队aChIP-seq+WGBS表观多组学揭示ROS1调控DNA去甲基化新机制

大家好这里是专注表观组学十余年领跑多组学科研服务的易基因。2026年4月2日华中农业大学赵伦教授与南方科技大学朱健康院士现澳门科技大学校长团队合作在《Nature Plants》期刊发表题为“Occupancy-based mechanism is the chief mode of ROS1 function in preventing DNA hypermethylation”的科研成果。该研究以甘蓝型油菜和拟南芥为对象系统揭示了DNA去甲基化酶ROS1在体内的主要作用机制打破此前ROS1主动去甲基化、从而抑制全基因组DNA高甲基化的传统认知提出并验证“占位机制Occupancy-based mechanism”是ROS1维持基因组DNA低甲基化的主要模式。本研究通过优化版染色质免疫共沉淀测序advanced ChIP-seqaChIP-seq和DNA甲基化组分析WGBS等表观多组学技术揭示ROS1通过其N端和C端结构域广泛结合几乎所有染色质开放区域通过物理占位拮抗RNA介导DNA甲基化RdDM通路的招募从而以“被动去甲基化”方式维持DNA低甲基化状态而非依赖广泛的酶切活性。此外研究还发现ROS1是染色质可及性的关键标志物和调控因子在DNA甲基化依赖和非依赖环境中均发挥染色质可及性调控作用并作为“储备保护者”或“现役保护者”动态响应表观遗传环境变化为作物表观遗传精准改良提供关键理论支撑。英文标题Occupancy-based mechanism is the chief mode of ROS1 function in preventing DNA hypermethylation译文标题基于占位机制是ROS1抑制DNA高甲基化的主要功能模式发表时间2026年4月2日发表期刊Nature Plants影响因子2025IF 13.6/Q1技术平台ChIP-seq、WGBS、ATAC-seq、RNA-seq等作者单位华中农业大学、南方科技大学等DOI10.1038/s41477-026-02258-z易小结本研究不仅重新定义ROS1在DNA甲基化调控和染色质可及性中的多重作用更揭示其通过“占位机制”实现基因组稳态的表观遗传调控机制为理解真核生物平衡表观遗传重编程与基因组完整性提供了新思路。研究应用aChIP-seq绘制了ROS1的全基因组结合图谱WGBS绘制了单碱基分辨率的DNA甲基化图谱是精准鉴定差异甲基化区域DMRs、定量甲基化水平变化、并最终验证“占位导致被动去甲基化”机制的重要方法。表观多组学技术联用在揭示复杂表观调控网络、解析作物农艺性状表观遗传基础等前沿研究中发挥重要作用。研究方法1、材料构建多种拟南芥突变体和转基因株系构建表达Flag标签的全长ROS1、截短变体如ΔN294、ΔC146以及催化失活突变体的转基因植物。甘蓝型油菜ROS1同源基因也采用类似策略。2、机制探索aChIP-seq优化版染色质免疫沉淀测序团队自主研发aChIP方法用于低丰度蛋白和特殊植物组织成功绘制ROS1及其家族蛋白DME/DML2/DML3以及RNA聚合酶IVNRPD1的全基因组高分辨率结合图谱。ATAC-seq染色质可及性测序全基因组范围内检测染色质可及性并分析其在不同基因型和组织中变化。全基因组重亚硫酸盐测序WGBS对野生型Col-0、ros1-4突变体、nrpd1-3、nrpd1-3 ros1-4以及各种转基因回补株系等进行WGBS分析。绘制全基因组DNA甲基化图谱、鉴定ros1-4中的差异高甲基化区域hyper-DMRs、比较不同基因型甲基化水平区分“主动去甲基化主导”和“被动去甲基化主导”位点、验证ROS1占位对抑制DNA甲基化的作用。RNA-seq转录组测序分析基因表达变化。组蛋白修饰ChIP-seq分析H3K4me3、H3K9ac、H3K4me1、H3K27me3和H3K9me2等代表性组蛋白修饰。3、体外酶活性实验验证ROS1及其D971A突变体的5mC糖基化酶/裂解酶活性。结果图形1ROS1占位几乎所有染色质开放区域研究首先通过优化版aChIP-seq技术成功绘制了ROS1的全基因组结合图谱。分析发现ROS1结合位点与ATAC-seq所定义的染色质开放区域高度共定位图1a-c。在不同组织幼苗地上部、根、茎和不同基因型组蛋白去乙酰化酶突变体hda6中ROS1占位水平与染色质可及性信号强正相关图1d-h。上述研究结果表明ROS1并非像先前经典研究认为的仅被招募到少数特定序列位点而是广泛地、非序列特异性地与几乎所有的染色质开放区域结合使其成为一个染色质可及性的关键标志物。这一发现是理解ROS1新功能机制的基础。图1ROS1占位机制随组织和基因型变化并与染色质可及性改变相关2N端和C端结构域对ROS1结合染色质可及性至关重要为探究ROS1如何结合染色质研究人员构建了敲除N端富集赖氨酸区域ΔN294、C端RNA识别基序结构域ΔC146或两者同时缺失ΔN294ΔC146的截短突变体。aChIP-seq分析显示这些截短显著减少甚至完全抑制ROS1与染色质可及性的结合力图2a-d。然而有趣的是这些仍能微弱结合的截短变体在全基因组范围内的分布模式与全长ROS1相似仍靶向避开异染色质标记H3K9me2区域。上述研究结果表明ROS1的N端和C端是其与染色质结合的主要决定因子而特定染色质环境如特定的组蛋白修饰可能对其结合有辅助作用。同时研究还发现ROS1家族其他成员DME/DML2/DML3以及甘蓝型油菜中的ROS1同源蛋白也表现出与染色质可及性相关的类似结合模式。图2N端和C端结构域对ROS1结合染色质可及性至关重要3ROS1直接调控仅部分ros1-4差异高甲基化区域鉴于ROS1在DNA去甲基化中的已知作用研究人员进一步探讨了ROS1占位与野生型植物中DNA甲基化的关系。WGBS分析显示DNA甲基化通常发生在ROS1结合位点之外而ROS1未结合位点则广泛发生甲基化图3a表明ROS1占位与DNA甲基化呈负相关。为检验ROS1在其结合位点维持低甲基化的作用研究人员通过整合ROS1结合谱和WGBS鉴定的ros1-4突变体中的差异高甲基化区域hyper-DMRs将基因组区域分为三类图3bI型区域ROS1结合但未发生高甲基化占ROS1结合位点的94%、II型区域ROS1结合且发生高甲基化占hyper-DMRs的25%和III型区域未检测到ROS1结合但发生高甲基化占hyper-DMRs的75%。这一分类清晰表明在绝大多数94%ROS1结合位点即使ROS1缺失也维持DNA低甲基化说明ROS1对于维持这些位点低甲基化并非必需。ROS1直接抑制DNA高甲基化的作用仅限于其结合位点中一小部分25%在ros1-4中的高甲基化区域II型。而大部分75%高甲基化区域III型未与ROS1结合ROS1通过间接机制抑制DNA高甲基化。图3ROS1占位、RdDM招募与DNA甲基化之间的关系4ROS1占位通过拮抗RdDM招募以维持DNA低甲基化为阐明ROS1如何直接维持低甲基化研究聚焦于RNA介导的DNA甲基化RdDM通路。通过分析ROS1和RdDM核心组件Pol IVNRPD1结合谱并综合分析ros1-4、nrpd1-3、nrpd1-3 ros1-4和野生型的DNA甲基化数据研究人员发现两种不同类型的RdDM靶位点图3fI型位点经典靶点无ROS1结合始终高甲基化和II型位点拮抗位点在野生型中ROS1占位而Pol IV信号和DNA低甲基化在ros1-4中ROS1缺失导致Pol IV招募和DNA甲基化显著增加图3e-i。为鉴定ROS1占位发挥功能的位点研究者通过连续基因靶向方法生成ROS1原位D971A替换植株并分析其相对于野生型和ros1-4的甲基化谱。分析结果发现在鉴定的1,444个ROS1结合hyper-DMRsros1-4 vs Col-0中93%保持与野生型相似的低甲基化状态仅7%102个位点表现出与ros1-4一致的强高甲基化图3j-k。这些结果进一步支持ROS1主要通过染色质占位机制在大多数靶位点维持低甲基化。5ROS1占位介导广泛非酶活性依赖的被动DNA去甲基化体外酶活性实验已显示ROS1作为糖基化酶/裂解酶活性glycosylase/lyase酶切5mC碱基以启动主动DNA去甲基化。但ROS1在体内通过主动或被动机制介导DNA去甲基化仍然未知。ROS1占位通过拮抗甲基化以维持低甲基化状态图3i这引出了其通过酶活性非依赖性方式介导被动去甲基化的假设。研究人员构建了催化活性位点突变体ROS1D971A酶活性缺失但结合能力保留。将野生型ROS1和ROS1D971A分别回补到ros1-4突变体中并进行DNA甲基化比较图4。研究鉴定出一批在ros1-4中高甲基化、能被野生型ROS1回补降低甲基化的位点。约65%的这些位点也能被缺失酶活性的ROS1D971A回补降低甲基化被动去甲基化主导位点而另一部分则不能主动去甲基化主导位点。更重要的是在ROS1D971A原位替换的植物中约94%的ROS1靶位点维持DNA低甲基化。这些发现表明ROS1占位介导的被动DNA去甲基化在植物中广泛发生。图4ROS1占位介导不依赖糖基化酶/裂解酶活性的被动DNA去甲基化。体外糖基化酶/裂解酶实验显示ROS1中Asp971突变为丙氨酸可抑制其5mC切割活性。野生型全长ROS1与突变体ROS1D971A-Flag/ros1-4在所有24,226个可及染色质区域峰周围区域的占位关联。ROS1 D971A表现出与野生型ROS1相似的全基因组占位和表观基因组特征。以野生型ROS1去甲基化位点为对照鉴定ros1-4中ROS1D971A去甲基化位点。共鉴定出603个野生型ROS1去甲基化位点这些位点被野生型ROS1和突变体ROS1D971A共同占位左图。其中396个位点在至少一个独立的ROS1D971A-Flag/ros1-4株系中被ROS1D971A去甲基化归为被动主导位点右图。剩余位点归为主动主导位点。主动主导ROS1D971A未去甲基化和被动主导ROS1D971A去甲基化位点的DNA甲基化水平。d和e的代表性示例。ChIP-seq信号以CPM显示甲基化水平以甲基化胞嘧啶比例显示。6ROS1独立或协同其他表观遗传调控因子维持染色质开放既然ROS1占位开放染色质研究进一步探究它是否影响可及性本身。ATAC-seq分析发现在ros1-4中有597个区域的可及性降低LARs而可及性升高区域HARs较少仅10个图5a-b表明ROS1能独立调控一部分染色质开放性。在rdd-2和drdd等多突变体中发现更多可及性降低区域且部分与这些突变体特有的hyper-DMRs重叠表明ROS1与同源蛋白DME、DML2/3在功能上存在冗余。此外与组蛋白乙酰转移酶GCN5或甲基转移酶SDG2的双突变分析也揭示ROS1与这些活性染色质修饰因子之间存在协同或冗余的多重调控机制共同维护关键区域的染色质开放性图5c-d。图5ROS1独立或与GCN5冗余维持染色质可及性7ROS1作为特定基因组区域染色质可及性的“储备保护者”发挥作用鉴于ROS1移除后大量开放区域持续存在研究者提出ROS1可能作为其中部分区域的储备保护者。为验证此假设尝试通过突变DNA甲基化调控因子建立有无DNA甲基化的比较系统然后评估ROS1移除后的染色质可及性变化图6a。在拟南芥中DNA甲基化主要由RdDM通路介导由五个功能性DNA甲基转移酶维持其中MET1负责CG甲基化DRM1、DRM2、CMT2和CMT3协同负责非CG甲基化。然而这些通路突变几乎完全抑制ROS1启动子DNA甲基化导致ROS1表达显著下调。而HDA6则通过与MET1互作调控特定位点DNA甲基化。尽管hda6突变体DNA甲基化降低且ROS1表达下调但仍有ROS1表达。因此研究人员使用hda6突变体建立有HDA6依赖DNA甲基化ros1-4 vs野生型和无HDA6依赖DNA甲基化hda6 ros1-4 vs hda6的比较系统评估ROS1移除后的染色质可及性变化图6b。结果共鉴定出290个无论HDA6存在与否ROS1均稳定结合的位点图6c-d。在存在HDA6依赖DNA甲基化时ros1-4 vs野生型ROS1移除导致DNA甲基化沉积和染色质可及性降低证明ROS1在这些位点以DNA甲基化依赖方式维持染色质开放而在无HDA6依赖DNA甲基化时hda6 ros1-4 vs hda6即使移除ROS1这些位点仍保持开放图6b,d。因此ROS1广泛结合染色质可及性但并非在所有结合位点发挥功能而是作为“储备保护者”仅在DNA甲基化发生时才变为“现役保护者”。图6ROS1在特定基因组区域负责染色质可及性的储备保护者8ROS1在DNA甲基化依赖和非依赖环境中调控染色质可及性鉴于ROS1在调控染色质可及性和DNA甲基化中的重要作用研究人员接下来分析了ROS1在特定位点调控染色质可及性的作用是否依赖DNA甲基化。研究对ros1-4中597个可及性降低区域LARs的DNA甲基化数据分析显示图7a其中543个位点在ros1-4中DNA甲基化水平显著上升DNA甲基化依赖性调控而54个位点在两种基因型中甲基化水平都很低DNA甲基化非依赖性调控。进一步分析发现一部分DNA甲基化依赖性的LARs与前述的RdDM II型位点重叠58个图7b。这些位点ROS1移除导致的可及性下降在nrpd1-3 ros1-4双突变中因RdDM通路被同时破坏而得以恢复图7c证实了“ROS1占位→拮抗RdDM→维持低甲基化和开放性”轴的存在。同时组织间的可及性动态变化大多发生在DNA甲基化缺失区域图7e表明并非所有染色质可及性变化都由DNA甲基化介导。图7ROS1在DNA甲基化依赖和非依赖环境中调控染色质可及性结论和启示本研究通过aChIP-seq、WGBS、ATAC-seq、RNA-seq等表观多组学综合分析揭示了ROS1主要基于其蛋白对染色质开放区域的物理占位以抑制DNA高甲基化的表观遗传调控机制。ROS1通过拮抗DNA甲基化复合体招募以促进被动去甲基化而非依赖其糖基化酶/裂解酶活性主动碱基切除的经典认知。机制创新ROS1主要通过“占位机制”而非酶催化活性维持DNA低甲基化破解了全基因组碱基切除与基因组稳定性之间传统认知的全新机制。功能拓展ROS1是染色质可及性的关键标志物和调控因子在DNA甲基化依赖和非依赖环境中均发挥调控作用。动态调控ROS1可作为“储备保护者”或“主动保护者”动态响应表观遗传环境变化。技术参考aChIP和WGBS等技术的整合应用为低丰度表观调控因子的全基因组研究提供了方法学参考。参考文献Deng L, Zhu G, Zhong W, Jia Z, Zhou Q, Zhang M, Si Z, Zhang Q, Liang Y, Du X, Mao Y, Wu J, Li G, Shen J, Zhu JK, Zhao L. Occupancy-based mechanism is the chief mode of ROS1 function in preventing DNA hypermethylation. Nat Plants. 2026 Apr 2. doi: 10.1038/s41477-026-02258-z.